發(fā)布時(shí)間：2019-03-01
2019年3月1日，《科學(xué)》發(fā)表了一篇名為《胞嘧啶單堿基編輯會(huì )導致大量單核苷酸突變的脫靶》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所（中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心）、上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室、中國科學(xué)院靈長(cháng)類(lèi)神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室楊輝研究組與中國科學(xué)院上海營(yíng)養與健康研究所隸屬的計算生物學(xué)研究所（中國科學(xué)院-馬普學(xué)會(huì )計算生物學(xué)伙伴研究所）、斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)系以及中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所合作完成。該研究建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術(shù)，并使用該技術(shù)發(fā)現: 近年來(lái)興起的單堿基編輯技術(shù)有可能導致大量無(wú)法預測的脫靶，因而存在嚴重的安全風(fēng)險。此研究顯著(zhù)提高了基因編輯技術(shù)脫靶檢測的敏感性，并且可以在不借助于任何脫靶位點(diǎn)預測技術(shù)的情況下發(fā)現之前的脫靶檢測手段無(wú)法發(fā)現的完全隨機的脫靶位點(diǎn)，為基因編輯工具的安全性評估帶來(lái)了突破性的新工具，有望成為新的行業(yè)檢測標準。
CRISPR/Cas9是廣泛關(guān)注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發(fā)明以來(lái)，它一直以其高效性和特異性備受世人的期待，學(xué)術(shù)界普遍認為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術(shù)將為人類(lèi)的健康做出巨大貢獻。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問(wèn)世以來(lái)，其脫靶風(fēng)險一直備受關(guān)注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話(huà)，脫靶效應可能會(huì )引起包括癌癥在內的很多種副作用。在此之前，人們推出過(guò)多種檢測脫靶的方案。以前的方法或者依賴(lài)于計算機軟件預測，或者依賴(lài)于高通量測序檢測DSB產(chǎn)生，還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。因此關(guān)于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實(shí)脫靶率一直存在爭議。因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術(shù)，將會(huì )成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關(guān)鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴(lài)于脫靶位點(diǎn)預測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。
因此，如果要提升檢測脫靶效應的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實(shí)現不借助于脫靶位點(diǎn)預測，這就要求必須找到非常嚴格的對照組來(lái)確定基因突變的位點(diǎn)；同時(shí)為了檢測不依賴(lài)于sgRNA的隨機突變，最好使用基于單細胞全基因組測序。為了實(shí)現以上目標，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術(shù)。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時(shí)候，編輯一個(gè)卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎發(fā)育到14.5天時(shí)，將整個(gè)小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術(shù)基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒(méi)有基因編輯細胞，再進(jìn)行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細胞體外擴增帶來(lái)的噪音問(wèn)題。而且由于實(shí)驗組和對照組來(lái)自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。
在楊輝實(shí)驗室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統被成功建立了起來(lái)。借助于這個(gè)系統，團隊成員先是檢測了最經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統。結果發(fā)現，設計良好的CRISPR/Cas9并沒(méi)有明顯的脫靶效應，這個(gè)結果結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個(gè)同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術(shù)BE3，這個(gè)系統可以精確引入點(diǎn)突變，在之前的研究中從未發(fā)現過(guò)有明顯的脫靶問(wèn)題。然而在GOTI的檢測下發(fā)現，BE3存在非常嚴重的脫靶，而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點(diǎn)，因此之前方法一直沒(méi)有發(fā)現其脫靶問(wèn)題。團隊分析后認為，這些脫靶位點(diǎn)有部分出現在抑癌基因上，因此經(jīng)典版本的BE3有著(zhù)很大的隱患，目前不適合作為臨床技術(shù)。研究團隊的這些重要發(fā)現，證實(shí)了以BE3為代表的部分基因編輯技術(shù)存在無(wú)法預測的脫靶風(fēng)險，讓世人重新審視了這些新興技術(shù)的風(fēng)險。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術(shù)，有望由此開(kāi)發(fā)精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標準。
該項工作由中科院神經(jīng)所博士后左二偉（現任中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所研究員），計算生物學(xué)所博士研究生孫怡迪，計算生物學(xué)所研究員魏武，中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所助理研究員袁堂龍等科研人員，在中科院神經(jīng)所楊輝研究員, 計算生物學(xué)所李亦學(xué)研究員，斯坦福大學(xué)Lars M. Steinmetz教授的共同指導下完成，課題組的其他成員積極參與，并得到了神經(jīng)所流式分選平臺、動(dòng)物平臺、基因編輯平臺的大力協(xié)助，是眾多課題組通力合作的重要成果。
圖1 GOTI技術(shù)的原理及實(shí)驗流程：(A) 實(shí)驗流程. (B) 脫靶位點(diǎn)數目比較。Cre-, Cas9-, BE3- and ABE7.10組分別有14+/-12 (SEM, n=2),12+/-4 (SEM, n=11),283+/-32 (SEM, n=6)和10 +/- 5 (SEM, n = 4)個(gè)SNVs。(C) 突變類(lèi)型的分布比較. 每個(gè)格子中的數字表示該種突變類(lèi)型占全部突變的比例 (D) 脫靶SNVs富集在基因組中的轉錄區域。(E) Genes 包含脫靶位點(diǎn)的基因在細胞胚胎中有更高的表達量。
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